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La cromatografia è un metodo analitico largamente utilizzato per la separazione, la purificazione, l’identificazione e la determinazione quantitativa dei componenti di miscele complesse.

Come funziona?

sfrutta le diverse interazioni (per affinità) che le sostanze da separare (chiamate analiti) fanno con le due fasi:

  • FASE STAZIONARIA: ferma fissa in colonna. Devono avere stabilità meccanica e chimica.
  • FASE MOBILE: scorre in modo continuo su fase stazionaria e trascina analiti

Fasi principali della corsa cromatografica
1) EQUILIBRAMENTO: si impacca la fase stazionaria e prima di caricare campione su qualunque colonna si fa passare passare un volume di tampone equivalente ad almeno cinque volte il volume della colonna
2) CARICAMENTO: il campione in soluzione viene caricato in colonna
3) LAVAGGIO solo per alcuni tipi di cromatografia, così da allontanare tutto il materiale che non interagisce con la fase stazionaria
4) ELUIZIONE: Fase in cui si recuperano gli analiti nella fase mobile in uscita dalla colonna. Avviene in diversi modi in base alla tecnica di separazione usata

Schema

schema di HPLC ossia cromatografia a fase liquida ad alte pressioni, rispetto agli altri tipi di cromatografia presenta l’aggiunta di una pompa.

All’uscita della colonna si ha un detector, rilevatore, utile per seguire l’andamento della corsa cromatografica monitorando gli analiti che escono dalla colonna e identificandoli con spettrofotometro o spettrometro di massa.

Si costruisce a computer (con la rielaborazione dei dati) un CROMATOGRAMMA, ossia un grafico dove in ordinata é riportata la risposta del detector (per esempio assorbanza) e in ascissa i tempi di uscita delle varie sostanze (chiamati tempi di ritenzione). Questo grafico è formato da una successione di vari picchi, corrispondenti alle varie sostanze in uscita dalla colonna che è stata registrata come segnale. Ogni picco è caratterizzato da: altezza e ampiezza alla base.

sopra colonna cromatografica in orizzontale, sotto cromatogramma corrispondente

Tecniche cromatografiche

Le separazioni possono avvenire in base a diverse caratteristiche degli analiti, riportate qui di seguito per l’analisi di proteine:

  • peso molecolare ossia la dimensione dell’analita –> gel filtrazione e cromatografia ad esclusione molecolare
  • carica e proprietà acido-base, in relazione ai gruppi carichi della proteina e al ph della soluzione –> cromatografia a scambio ionico
  • affinità tra l’analita in esame e una sostanza immobilizzata su fase stazionaria –> cromatografia di affinità, un esempio è IMAC
  • idrofilia / idrofobicità –> cromatografia a fase inversa, ad interazione idrofilica, ad interazione idrofobica.

foto copertina: idee green